В основе реакции ле­жат два явления - бактериолизис и гемолиз. В их проявлении уча­ствует комплемент. Поэтому в РСК применяют две системы ком­понентов: 1) обеспечивает феномен бактериолизиса и использует­ся для диагностических целей; 2) гемолитическая, индикаторная, вспомогательная; позволяет установить, связался или не связался комплемент в первой системе (см. схему цв. рис. I). Ранее в каче­стве антигена использовали взвесь бактерий, поэтому первая сис­тема была названа бактериолитической (в положительных случаях происходил лизис бактерий).

Постановку РСК осуществляют в два этапа. На первом этапе готовят бактериолитическую систему: в пробирках смешивают по 0,5 мл исследуемой сыворотки с антигеном, добавляют комп­лемент в строго определенной дозе (титре). Смесь антиген - сы­воротка-комплемент (бактериолитическая система) выдержи­вают в водяной бане (или термостате) 20...40 мин при 37...38 "С. Результат взаимодействия компонентов в пробирке невидим, жидкость остается прозрачной и бесцветной. Чтобы определить, связался ли комплемент в бактериолитической системе, осуще­ствляют второй этап реакции: в пробирки добавляют компонен­ты гемолитической системы - отмытые эритроциты барана и инактивированную гемолитическую сыворотку, как показано в схеме. Все компоненты бактериолитической системы встряхива­ют для перемешивания в пробирке, помещают в водяную баню при 37...38 "С на 20...40 мин. Затем добавляют компоненты гемологической системы, вторично все встряхивают и вновь помеща­ют в водяную баню на 10...15 мин.

Предварительный учет результата. Если сы­воротка получена от больного животного, то в ней содержатся ан­титела, которые соединяются со специфическим антигеном. С этим комплексом (антиген - антитело) связывается компле­мент - гемолиз не происходит, результат положительный.

В сыворотке от здорового животного антитела отсутствуют: комплекс антиген - антитело не образуется, комплемент в бакте­риологической системе не связывается. При добавлении эритро­цитов и гемолизина (это между собой антиген и антитело) комп­лемент реагирует с этим комплексом - произойдет гемолиз, ре­зультат отрицательный (см. цв. рис. II).

Окончательный учет результата. Пробирки оставляют при комнатной температуре на 15...20 ч. Если в бакте-риолитической системе сыворотка была от больного животного, в пробирке образуется специфический комплекс антиген - антите­ло, который адсорбирует (связывает) весь добавленный компле­мент. Следовательно, во второй, гемолитической, системе гемоли­за не произойдет, эритроциты осядут на дно пробирки, надоса-дочная жидкость прозрачная. Результат РСК положительный.

Если в исследуемой сыворотке нет специфических антител к используемому антигену (в случаях, когда сыворотка от здорового животного), в бактериолитической системе комплекс антиген - антитело не образуется и, следовательно, комплемент в данной системе не адсорбируется, а остается свободным. При добавлении компонентов гемолитической системы (во второй фазе реакции) комплемент вступает во взаимодействие со вторым комплексом (гемолизин -эритроциты), происходит гемолиз эритроцитов - осадок не образуется, жидкость в пробирке лаково-красного цве­та. Результат РСК отрицательный.

РСК. используют: 1) для обнаружения в сыворотке больного животного специфических антител (при диагностике бруцеллеза, перипневмонии, сапа, лептоспироза, трипанозомоза и др.); 2) для выявления в исследуемом материале специфического антигена (бактериального или вирусного) при наличии специфической им­мунной сыворотки.

Для постановки РСК необходимо иметь: пробы сывороток, по­ступившие для исследования; две сыворотки, заведомо позитив­ные (стандартные, обеспечивающие положительный результат), и две нормальные сыворотки. Все сыворотки в разведении 1: 10 инактивируют при 56...58 °С 30 мин; антиген в разведении соглас­но титру; комплемент, разведенный в соответствии с установлен­ным титром при титровании в бактериолитической системе; гемо­лизин в рабочем титре; эритроциты барана (I: 40); физиологичес­кий раствор, градуированные пипетки, пробирки, штативы, водя­ную баню на 37...38 °С.

Перед постановкой РСК кровь барана дефибринируют, эрит­роциты отмывают физиологическим раствором путем центрифу­гирования до полной прозрачности надосадочной жидкости, ко­торую удаляют отсасыванием, а осажденные эритроциты разводят в физиологическом растворе 1:40 (2,5 %). Антиген разводят со­гласно титру, указанному на этикетке биофабрикой. Гемолизин и комплемент перед постановкой РСК титруют.

Антиген для РСК готовят на биофабриках. Обычно это экстракты разрушенных микробных взвесей {или вируссодержа-гдей ткани). Антигены не должны обладать гемолизирующим дей­ствием, что контролируется в процессе постановки реакции (в пробирку наливают 1...2 дозы антигена и 0,5 мл взвеси эритроци­тов: гемолиза не должно быть). На ампуле с антигеном биофабри­ка указывает, что он предназначен для РСК (сапной, бруцеллез­ный или другой). На упаковочной коробке указаны номер серии, дата изготовления, срок годности, активность антигена, то есть в каком разведении его надлежит использовать при постановке РСК (1:100, 1:150 и др.). При некоторых заболеваниях антигеном слу­жат другие материалы; например, для диагностики перипневмо-нии крупного рогатого скота антигеном для РСК служит лимфа теленка, экспериментально зараженного подкожно или интра-плеврально. При длительном хранении антигенов их титр вновь проверяют в лаборатории по специальной схеме титрования.

Испытуемые сыворотки, поступившие для иссле­дования, разводят физиологическим раствором 1: 5 или 1: 10, инактивируют прогреванием в водяной бане для разрушения соб­ственного комплемента 30 мин при 56...58 "С (сыворотки ослов, мулов, лошаков - при 61 °С).

Гемолизин готовят на биофабриках путем гипериммуни­зации кроликов отмытыми эритроцитами барана. Для этого кро­ликам внутривенно вводят 4...5 раз с 2...3-дневными интервалами 40...50%-ю взвесь эритроцитов. Через неделю после последней инъекции у кроликов берут кровь, стерильно отсасывают сыворот­ку, инактивируют ее, консервируют глицерином 1:1 или 0,5%-м фенолом, титруют, разливают по ампулам. В лабораториях перед постановкой РСК вновь титруют.

Схема титрования гемолизина. Необходимо подготовить: i) раз­ведение комплемента 1: 20; 2) гемолизин 1:100 (0,2 мл гемолизи­на+9,8 мл физраствора); 3) взвесь эритроцитов барана 1:40; 4) физиологический раствор NaCl.

Для постановки реакции титрования в штативе размещают два ряда пробирок - один вспомогательный только для приго­товления разведений гемолизина, второй - собственно для тит­рования. В первую пробирку каждого ряда вносят исходное раз­ведение гемолизина 1: 100, а затем производят последователь­ное разведение. Все пробирки встряхивают и помеща­ют в водяную баню при 37...38°С на 10...15 мин. Учет результата: в данном примере наименьшее количество (или его наибольшее разведение), давшее полный гемолиз, составляет 1: 2000, т. е. это его фактический титр. Рабочий титр в 2 раза кон­центрированнее - 1:1000.

По 0,5 мл (указано стрелками) каждого разведения из пробирок первого ряда переносят в отдельные пробирки второго ряда. Во все пробирки второго ряда добавляют по 0,5 мл комплемента (1: 20), по 0,5 мл эритроцитов барана (2,5%-я взвесь, или 1: 40) и по 1 мл физраствора, чтобы объем жидкости в каждой пробирке составлял 2,5 мл.

Примечание. Исходя из того что в окончательной постановке РСК будут участвовать 5 компонентов по 0,5 мл, которые составят объем 2,5 мл, на протяже­нии всей работы этот объем соблюдается.

Пробирки встряхивают и помещают в водяную баню на 10...15 мин. Гемолиз прежде всего произойдет в пробирках с боль­шим содержанием гемолизина (наименьшим его разведением - 1: 500, 1:1000...). Наименьшее количество гемолизина (наиболь­шее его разведение), вызвавшее полный гемолиз эритроцитов в данных условиях, называется предельным (фактическим) титром гемолизина. Для дальнейшей работы гемолизин используют в 2 раза концентрированнее, то есть в удвоенном количестве, удвоенном титре, который называют рабочим титром. Например, если фактический титр I: 2500 (или 1: 2000), то рабочий титр соответ­ствует разведению 1:1250 (или 1: Ш00).

К о м п л е м е н т -это составная часть свежей сыворотки, лимфы, тканевых жидкостей разных видов животных (и челове­ка); открыт Бухнером (1889). У насекомых комплемент отсутству­ет. Комплемент - вещество белковой природы, сложной структу­ры, быстро инактивируется при нагревании, длительном хране­нии, воздействии ультрафиолетового излучения, сильном встря­хивании, фильтрации через керамические фильтры, добавлении каолина, кислот, щелочей, алкоголя, ацетона, хлороформа, дис­тиллированной воды, взвеси бактерий и др. Комплемент можно консервировать добавлением на 100 мл сыворотки морской свин­ки 5 г сульфата натрия, 4 г борной кислоты. Активность компле­мента при этом сохраняется до полугода. Лучший способ консер­вирования - высушивание в условиях вакуума при низкой темпе­ратуре (лиофилизация). В запаянных ампулах в таком состоянии он сохраняется два года. Перед каждой постановкой РСК актив­ность комплемента проверяют титрованием, то есть определяют его титр - оптимальное количество, необходимое для данной ре­акции. Комплемент титруют дважды: в гемолитической и бактери-олитической системах.

Для титрования комплемента в гемолитической системе готовят компоненты: комплемент в разведении 1: 20 (1 мл комплемента + 19 мл физраствора); гемолизин, разведенный соответственно ра­бочему титру; взвесь отмытых эритроцитов барана (1: 40), физио­логический раствор. В штатив ставят пробирки и разливают в них градуированной пипеткой разное количество комплемента с ин­тервалом 0,03 мл (0,13; 0,16; 0,19; 0,22..: до 0,43 мл). Затем добав­ляют остальные компоненты (рис. 57). Все пробирки встряхивают и помещают в водяную баню при 37...38 "С на 10...15 мин и прово­дят учет результата.

Учет результата: наименьшее количество комплемента, обеспе­чившее полный гемолиз (в данном примере - 0,25 мл), принима­ют за титр комплемента.

Результат титрования начинают учитывать в пробирках с наи­большим содержанием комплемента, где прежде всего ожидается гемолиз. Наименьшее количество комплемента, обеспечившее полный гемолиз эритроцитов при данных условиях, называют титром комплемента в гемолитической системе.

Для титрования комплемента в бактериолитической системе необходимо иметь все компоненты реакции: комплемент (1:20), эритроциты (1: 40), гемолизин в рабочем титре, две позитивные и две нормальные сыворотки, специфический антиген. Сыворотки разводят физраствором 1: 10, инактивируют 30 мин при 56...58 X. Каждую сыворотку разливают в два ряда пробирок по 0,5 мл. В пробирки каждого ряда добавляют комплемент в возрастающих количествах, как при титровании в гемолитической системе; на­чинают с количества, принятого за титр в гемолитической систе­ме, затем в каждой последующей пробирке дозу увеличивают на 0,03 мл, выравнивая объем до 0,5 мл физиологическим раствором.

После этого в один ряд пробирок с позитивной и нормальной сы­воротками добавляют по 0,5 мл антигена, во второй ряд каждой сы­воротки-по 0,5 мл физиологического раствора. Все пробирки встряхивают и ставят в водяную баню на 30...40мин. Затем во все пробирки вносят по 0,5 мл гемолизина и по 0,5 мл эритроцитов, встряхивают и вторично помещают в водяную баню на 10...15 мин. Наименьшее количество комплемента, обеспечившее полный лизис эритроцитов в обоих рядах пробирок (с антигеном и без антигена) двух нормальных сывороток, в одном ряду (без антигена) каждой по­зитивной сыворотки и с полной задержкой (отсутствием) гемолиза в рядах позитивных сывороток с антигеном (в тех же дозах комплемен­та), называют титром комплемента, который используют в поста­новке главного опыта РСК при диагностических исследованиях.

Главный опыт РСК (собственно диагностическое исследование). В штативы ставят два ряда пробирок по количеству исследуемых проб сывороток. По 0,5 мл каждой инактивирован-ной сыворотки наливают в две пробирки: в одну добавляют анти­ген - 0,5 мл, в другую (без антигена) 0,5 мл физраствора и, доба­вив комплемент, составляют бактернолитическую систему, а затем добавляют гемолитическую.

Необходимые компоненты: 1) исследуемая сыворотка, инактивированная, разве­денная физиологическим раствором 1: 10; 2) специфический ан­тиген, разведенный согласно титру, указанному биофабрикой на этикетке упаковки; 3) комплемент в установленном титре; 4) ге­молизин в рабочем титре; 5) взвесь отмытых эритроцитов барана 1: 40; 6) физиологический раствор NaCI. Исследуемые сыворотки разливают в два ряда пробирок. Для любого количества исследуе­мых сывороток в качестве контроля используют заведомо пози­тивную сыворотку (дающую положительный результат) и нор­мальную (от здорового животного, дающую отрицательный ре­зультат).

Пробирки с компонентами бактериолитической системы встряхивают, помещают в водяную баню на 20...40 мин при 37...38°С. Пробирки бактериолитической системы второго ряда без антигена встряхивают, помещают в водяную баню при тех же условиях.

Затем во все пробирки первого и второго ряда добавляют ком­поненты гемолитической системы, вторично помещают в водяную баню на 10..15 мин. Во всех пробирках второго ряда без антигена наступает полный гемолиз.

До получения оконча­тельного результата пробир­ки оставляют при комнат­ной температуре на 18...24 ч. Во всех пробирках без анти­гена, независимо, от боль­ного или от здорового жи­вотного получена сыворотка, должен наступить гемолиз, в пробирках первого ряда с антиге­ном более четкий результат выражен при отстаивании.

Показания реакции в пробирках с испытуемыми сыворотками считают достоверными, если в пробирках с позитивными сыво­ротками и антигеном гемолиз отсутствует при полном гемолизе в пробирках с позитивной сывороткой без антигена и во всех про­бирках с заведомо нормальной сывороткой (рис. 61).

Данная реакция должна сопровождаться контролями антигена, комплемента, гемолизина, эритроцитов. Для этого в отдельные пробирки наливают антиген с эритроцитами барана; комплемент с эритроцитами без гемолизина; гемолизин с эритроцитами без комплемента; эритроциты и физиологический раствор. Объем в каждой пробирке доводят физраствором до 2,5 мл. Пробирки встряхивают, помещают в водяную баню при 37 °С на 20 мин. Во всех контрольных пробирках гемолиз должен отсутствовать.

Результат РСК принято выражать в «крестах». Показатели по­ложительного результата реакции: + + + + (///) - полное осаж­дение эритроцитов (нет гемолиза), жидкость над осадком бесцвет­ная, + + + (///) - жидкость над осадком едва заметно окрашена в желтоватый цвет. Сомнительный результат реакции: наличие осевших на дне эритроцитов и частичное окрашивание надосадоч-ной жидкости за счет лизиса некоторой части эритроцитов обо­значают + + - (++), то есть два и два с половиной креста. Резко выраженный гемолиз (без осадка) или с небольшим осадком (+) - отрицательный результат.

Реакция длительного связывания комплемента (РДСК). Более эффективная по чувствительности в отличие от обычной класси­ческой РСК. Суть реакции заключается в том, что бактериолити-ческую систему выдерживают при трех различных температурных режимах: после смешения компонентов при комнатной темпера­туре 15 мин, затем при низкой температуре (4 °С) в рефрижераторе 18...20 ч и в водяной бане 15 мин. После этого добавляют гемоли­тическую систему, встряхивают, вновь помешают в водяную баню и производят учет реакции, как при РСК. Подтверждена эффек­тивность РДСК при диагностике ряда инфекционных болезней (туберкулез, вибриоз, бруцеллез идр,).

Реакция подавления связывания комплемента (РПСК), или реак­ция торможения, непрямая РСК. В данной реакции участвует еще один компонент - стандартная иммунная сыворотка, содержащая антитела к антигену, используемому обычно для диагностики и, следовательно, положительно реагирующая в классической РСК.

Исследуемую сыворотку смешивают с антигеном и некоторое время выдерживают без комплемента. Затем добавляют компле­мент и стандартную сыворотку, пробирки встряхивают и помеща­ют в водяную баню на 20...30 мин, после чего добавляют гемоли­тическую систему и вновь ставят в водяную баню. Если нет гемо­лиза-результат отрицательный, потому что испытуемая сыво­ротка не реагировала с антигеном и последний вступил в реакцию со стандартной сывороткой, связав комплемент. Если исследуемая сыворотка от больного животного, она содержит специфические антитела по отношению к антигену, т. е. происходит реакция меж­ду антигеном и антителами, не связывая комплемент. Антиген, взаимодействуя с антителами исследуемой сыворотки, не вступает в реакцию (подавляется) со стандартной (заведомо известной спе­цифической) сывороткой, комплемент остается свободным и вступает в реакцию в гемолитической системе - происходит гемо­лиз, результат реакции положительный по отношению к исследуе­мой сыворотке.

Метод флуоресцирующих антител (МФА). Возможности данно­го метода обусловлены специфичностью первой фазы серологи­ческих реакций с высокой чувствительностью люминесцентного анализа. Для осуществления МФА необходимо иметь высокоспе­цифические иммунные люминесцирующие сыворотки. Известно, что в различных серологических реакциях, используемых в мик­робиологической практике, участвуют преимущественно три ком­понента: бактерийный антиген, антитело и комплемент. Все три компонента, по сути, являются антигенами, и против каждого из них могут быть получены иммунные сыворотки и, соответствен­но, люминесцирующие антитела. В зависимости от того, какого типа люминесцируюшую сыворотку используют (против бакте­рийного антигена, антибактериальных антител, комплемента), различают три основных варианта метода флуоресцирующих ан­тител: прямой (1) и непрямой (2) варианты и модификация непря­мого варианта с использованием комплемента. Иммунологичес­кая реакция между антигеном и антителом осуществляется в этих модификациях непосредственно на предметном стекле. Для фик­сации микроорганизмов применяют органические растворители: ацетон, этанол, метанол, диоксан, а также обычные фиксаторы, используемые в микробиологической практике: формалин, смесь Никифорова, жидкость Карнуа и др.

Прямой вариант. На готовый препарат наносят специ­фическую люминесцирующую сыворотку на определенное время, затем излишек сыворотки сливают, препарат промывают и про­сматривают в люминесцентном микроскопе. Этот метод применя­ют для обнаружения бактерий в патологическом материале, объектах внешней среды, а также для идентификации возбудите­лей заболеваний в культурах.

Непрямой (двухступенчатый) вариант. На первом этапе происходит специфическое соединение антигена с соответствующим антителом немеченой сыворотки. На втором этапе специфическое немеченое антитело связывается с антивидо-вым люминесцирующим антителом, содержащимся в сыворотке животного, иммунизированного глобулинами (или цельной сыво­роткой крови) того вида животных, от которых была использована иммунная сыворотка.

Непрямой антикомплементарный (трех­ступенчатый) вариант. Первый этап: образование ком­плекса антиген - немеченое антитело. Второй этап: наслаивание нормальной сыворотки, содержащей комплемент. Третий этап: комплекс антиген - антитело - комплемент обрабатывают люми-несцируюшей антикомплементарной сывороткой, приготовлен­ной при иммунизации кроликов сывороткой того вида животного, которое служило источником комплемента.

Непрямые варианты МФА можно использовать как для выяв­ления антигенов, так и для определения антител. Кроме того, для постановки двухступенчатого варианта нужно иметь ограничен­ный набор антивидовых люминесцирующих сывороток (против глобулинов быка, барана, лошади, свиньи и др.), а для антикомп­лементарного варианта достаточно иметь всего одну люминесци­рующую сыворотку против глобулинов морской свинки.

Методика и м м у н о л ю м и н е с u e н т н о и мик­роскопии. В практике ветеринарных бактериологических ла­бораторий используют люминесцирующие сыворотки биофабрич­ного производства. В зависимости от типа флуорохрома люминес­цирующие сыворотки обеспечивают либо зеленое свечение объек­та (краситель на основе флуоресценна), либо красное (краситель на основе родамина).

Для проведения иммунолюминесцентной микроскопии следу­ет на обезжиренное тонкое без царапин предметное стекло нанес­ти исследуемый материал. При исследовании органов и тканей животных готовят препараты-отпечатки тонким слоем. Препара­ты подсушивают на воздухе и помещают в фиксирующую жид­кость (этанол - 15 мин, метанол - 5 мин, ацетон - 5 мин). Если необходимо, после фиксации препараты некоторое время можно сохранять в холодильнике. Последовательность и дальнейшие процедуры зависят от применяемого варианта МФА (одноступен­чатый, двухступенчатый, трехступенчатый). Обработку препаратов люминесцирующими сыворотками, а также немечеными сы­воротками первой ступени и комплементом проводят при 37 X в условиях влажной камеры {чашки Петри с увлажненной фильтро­вальной бумагой) .

Одноступенчатый вариант. На предметное стекло с фиксиро­ванным исследуемым материалом наносят люминесцирующую сыворотку (в разведении, указанном на ампуле). Препарат поме­щают во влажную камеру на 15...20 мин при 37 "С. Затем его про­мывают забуференным физиологическим раствором (рН 7,4) в со­суде, меняя раствор через 5...10 мин несколько раз, или под струей водопроводной воды в течение 3...5 мин. Вода должна быть нейт­ральной и не содержать железа. Затем препарат (на одном стекле может быть несколько мазков) подсушивают на воздухе или филь­тровальной бумагой, после чего наносят каплю забуференного глицерина с рН 8,0 и покрывают покровным стеклом. На покров­ное стекло наносят иммерсионную нефлуоресцирующую жид­кость и микроскопируют.

Двухступенчатый вариант. На предметное стекло с исследуе­мым материалом наносят каплю иммунной немеченой сыворотки первой ступени. Препарат помещают в термостат в условиях влаж­ной камеры на 15...20 мин. Затем его промывают, как описано выше, подсушивают и наносят каплю люминесцирующей антиви-довой сыворотки. Препарат снова помещают в термостат в усло­виях влажной камеры на 15...20 мин. Повторяют процедуру про­мывания и высушивают фильтровальной бумагой. Наносят забу-ференный глицерин, покрывают покровным стеклом, наносят не­флуоресцирующую иммерсионную жидкость и микроскопируют.

Трехступенчатый вариант (антикомплементарный). На пред­метное стекло с исследуемым материалом наносят каплю иммун­ной немеченой сыворотки первой ступени. Препарат помещают в термостат, как описано выше, подсушивают и на мазок наносят каплю комплемента. Препарат вновь помещают во влажную каме­ру и в термостат на 15...20 мин, после чего промывают и наносят люминесцирующую антикомплементарную сыворотку. Последу­ющие процедуры аналогичны одноступенчатому варианту.

Приготовление и обработка конт­рольных препаратов. 1. Для прямого варианта с целью определения специфичности реакции между антигеном с люминес­цирующей сывороткой следует этой же сывороткой обработать пре­параты-мазки из гетерологичных видов микробов. Эти виды долж­ны быть близкие в антигенном отношении, но отличающиеся по морфологии от исследуемых микроорганизмов; далекие в антиген­ном отношении к исследуемым микроорганизмам, но сходные по морфологии и распространению с ними. Препараты-отпечатки об­рабатывают люминесцирующей нормальной сывороткой.

2. Для непрямого варианта необходимо иметь три контрольных препарата, обработанных нормальной сывороткой, люминесцирующей антивидовой сывороткой без иммунной немеченой сыво­ротки и люминесцирующей антивидовой сывороткой с заведомо иммунной сывороткой первой ступени.

3. Для непрямого варианта с комплементом необходимы конт­рольные препараты, при обработке которых иммунная сыворотка заменена нормальной сывороткой того же вида и в тех же разведе­ниях, а также препараты, обработанные всеми ингредиентами, кроме иммунной сыворотки.

Оценка результатов. Учитывают яркость, цвет, ло­кализацию и структуру свечения. Бактерии, окрашенные люми­несцирующей сывороткой, меченной изотиоцианатом флуоресце-ина, имеют яркое зеленое свечение по периферии в виде ободка или ореола, центральная часть светится слабо. Такое свечение на­зывается специфическим в отличие от неспецифического, когда все тело клетки светится равномерно. Чем более выпукло лежит бактерийная клетка в препарате, тем резче ободок. Объяснить та­кое свечение можно тем, что с единицы площади «периферии» клетки на сетчатку глаза наблюдателя проецируется в несколько раз больше антител, чем с центральной части клетки микроба. Следует иметь в виду, что у пластичных клеток (лептоспиры, виб­рионы) нет контура или он заметен слабо. У клеток, погруженных в тканевую жидкость, и у молодых бацилл сибирской язвы контур обычно выражен нерезко.

Интенсивность свечения оценивают по четырехкрестовой сис­теме: + + + + - очень яркая флуоресценция по периферии мик­робной клетки, четко контрастирующая с темным телом клетки; + + + - яркая флуоресценция периферии клетки; + + - слабое све­чение периферии клетки; + - нет контрастного свечения перифе­рии тела микробной клетки. Отсутствие специфического свечения обозначают «-» (видны тени микроорганизмов). При диагностике различных возбудителей положительным результатом чаще всего считают специфическое свечение бактерийных клеток не ниже чем на четыре или на три креста.

Реакцию связывания комплемента (РСК) используют для выявления антител на определенный антиген или определяют тип антигена по известному антителу. Это сложная серологическая реакция, в ней участвуют две системы и комплемент. Первая система – бактериологическая (основная), состоит из антигена и антитела (один известный, другой нет). Вторая система – гемолитическая (индикаторная). В нее входят эритроциты барана (антиген) и соответствующая им гемолитическая сыворотка (антитело). РСК ставят в два приема: вначале соединяют антиген с испытуемой сывороткой крови, в которой отыскивают антитело, а затем добавляют комплемент. Если антиген и антитело соответствуют друг другу, то образуется иммунный комплекс, который связывает комплемент. При отсутствии в сыворотке антител иммунный комплекс не образуется и комплемент остается свободным. Поскольку процесс адсорбции комплемента комплексом визуально невидимый, то для выявления этого процесса добавляют гемсистему. Реакцию учитывают следующим образом. Если в первой (баксистеме) комплемент связался, то при добавлении гемсистемы гемолиз эритроцитов не произойдет – реакция положительная. Если же комплемент не связался в первой системе из-за отсутствия антител, то он свяжется с гемсистемой, в результате чего произойдет гемолиз эритроцитов – реакция отрицательная.

Антигены для РСК готовят из убитых и разрушенных микробов, чаще путем экстрагирования.

РСК широко используют для диагностики бруцеллеза, сапа, риккетсиозов, ящура и многих других.

Реакция длительного связывания комплемента (РДСК). Это вариант обычной РСК, но отличающийся тем, что первая фаза реакции протекает в течение 16–18 ч на холоде (4°С). В таких условиях в первой системе в комплексе антиген – антитело – комплемент дополнительно связываются и криофильные (холодовые) антитела, что повышает чувствительность реакции. Этот вариант используют для диагностики бруцеллеза, кампилобактериоза и др.

Реакция связывания комплемента (РСК) впервые описана Борде и Жангу (1901). В отличие от РА и РП при РСК соединение антигена с антителом проявляется только в присутствии третьего компонента – комплемента.

Реакция образования комплекса, Антиген – антите Ло – комплемент – невидимая. Чтобы выявить указанное взаимодействие компонентов реакции, используют дополнительную индикаторную систему, которая по своей наглядности проявления косвенно отражает результат взаимодействия в первой системе. Таким образом; в РСК участвуют две системы: 1) бактериолитическая (диагностическая) и 2) гемолитическая (вспомогательно-индикаторная), которая позволяет установить, произошло ли связывание комплемента в первой системе. Ранее в качестве, антигена использовали взвесь бактерий, и в положительных случаях происходил их лизис (бактериолиз), поэтому первая система получила название бактериолитической. Следовательно, в основу РСК легли два явления – бактериолиз и гемолиз.

РСК осуществляют в два этапа. Сначала готовят бактериолитическую систему – в пробирках смешивают по 0,5 мл исследуемую инактивированную сыворотку с антигеном, добавляют комплемент в строго определенном количестве (титре). Смесь антиген – антитело (сыворотка) – комплемент (бактериолитическая система) помещают в водяную баню (или термостат) при 37–38 °С на 20–40 мин. Далее приступают ко второму этапу реакции – во все пробирки добавляют компоненты второй гемолитической системы и вновь ставят в водяную баню на 15–20 мин. Затем учитывают предварительный результат (есть или нет гемолиза), оставляют при комнатной температуре до следующего дня и производят окончательный учет РСК. Отсутствие гемолиза (положительный диагностический результат) свидетельствует, что в испытуемой сыворотке имеются антитела, специфичные взятому антигену, комплекс антиген – антитело в первой системе образовался, комплемент связался. Добавляют компоненты второй системы – гемолизин и эритроциты, которые один по отношению к другому тоже являются антигеном (эритроциты) и антителом (гемолизин) и взаимодействуют в присутствии комплемента. Если же в исследуемой сыворотке нет антител, специфичных к взятому антигену, комплекс антиген – антитело не образуется и комплемент в первой бактериолитической системе не адсорбируется, остается в пробирке свободным, то при добавлении второй (гемолитической) системы комплемент взаимодействует с комплексом антиген – антитело (гемолизин – эритроциты) и происходит гемолиз (лизис эритроцитов). Диагностический результат отрицательный. Таким образом, в РСК участвуют 5 компонентов: антиген, антитело (исследуемая сыворотка), комплемент, гемолизин, взвесь эритроцитов барана. Для разведения всех компонентов используется электролитная среда–физраствор NaС1.

Для постановки РСК в диагностической лаборатории необходимо следующее: пробы сывороток от животных, поступившие в лабораторию для исследования; две сыворотки заведомо позитивные (стандартные, гипериммунные, обеспечивающие положительный результат – для контроля) и две нормальные сыворотки от здоровых животных – также для контроля (все сыворотки в разведении 1: 10 инактивируют для разрушения их собственного комплемента нагреванием в водяной бане при 56–58 °С 30 мин); антиген в разведении согласно титру (указанному биофабрикой на упаковке); комплемент (сыворотка морской свинки) в разведении соответственно установленному титру (при титрации); гемолизин в рабочем титре; взвесь эритроцитов барана в разведении 1: 40, физиологический раствор, градуированные пипетки различной емкости, пробирки, штативы, водяная баня, резиновые груши.

Реакция связывания комплемента (РСК) ставится в две фазы: в первой фазе антиген соединяют с исследуемой сывороткой, в которой предполагают наличие антител и добавляют комплемент, инкубируют в термостате 30 минут.

Вторая фаза: добавляют гемолитическую систему (эритроциты барана +гемолитическая сыворотка). После инкубации в термостате в течение 30 минут учитывают результат.

При положительной РСК антитела сыворотки, соединившись с антигеном, образуют иммунный комплекс, который присоединяет к себе комплемент, и гемолиза не произойдет. Если реакция отрицательная (антител в исследуемой сыворотки нет) - комплемент останется свободным и произойдет гемолиз.

РСК применяется для серологической диагностики сифилиса, гонорее, сыпного тифа и других заболеваний.

Реакции иммунитета с использованием меченых антигенов и антител основаны на том, что один из ингредиентов, участвующих в реакции (антигены или антитела) соединяют с какой-либо меткой, которую легко можно обнаружить. В качестве метки используют флюорохромы (РИФ), ферменты (ИФА), радиоизотопы (РИА), электроноплотные соединения (ИЭМ).

Иммуноферментный анализ (ИФА), как и другие реакции иммунитета, используется: 1) для определения неизвестного антигена с помощью известных антител или 2) для выявления антител в сыворотке крови с помощью известного антигена. Особенность реакции в том, что известный ингредиент реакции соединён с ферментом (например, пероксидазой). Присутствие фермента определяют с помощью субстрата, который при действии фермента окрашивается. Наиболее широко применяется твёрдофазный ИФА.

1) Обнаружение антигена. Первый этап - адсорбция специфических антител на твёрдой фазе, в качестве которой используют полистироловые или поливинилхлоридные поверхности лунок пластиковых панелей. Второй этап - добавление исследуемого материала, в котором предполагается наличие антигена. Антиген связывается с антителами. После этого лунки промывают. Третий этап - добавление специфической сыворотки, содержащей антитела против данного антигена, меченые ферментом. Меченые антитела присоединяются к антигенам, а их избыток удаляется промыванием. Таким образом, если в исследуемом материале имеются антигены, на поверхности твёрдой фазы образуется комплекс антитела - антиген - антитела, меченые ферментом. Для обнаружения фермента добавляют субстрат. Для пероксидазы субстратом служит ортофенилендиамин в смеси с Н 2 О 2 в буферном растворе. Под действием фермента образуются продукты, имеющие коричневую окраску.

2) Обнаружение антител. Первый этап - адсорбция специфических антигенов на стенках лунок. Обычно в коммерческих тест-системах антигены уже адсорбированы на поверхности лунок. Второй этап - добавление исследуемой сыворотки. При наличии антител образуется комплекс антиген-антитело. Третий этап - после отмывания в лунки добавляют антиглобулиновые антитела (антитела против человеческих глобулинов), меченые ферментом. Результаты реакции оценивают, как указано выше.

В качестве контролей используют образцы заведомо положительные и заведомо отрицательные, которые имеются в коммерческих системах.

ИФА применяется для диагностики многих инфекционных заболеваниях, в частности, ВИЧ-инфекции, вирусных гепатитов.

Иммуноблоттинг - это разновидность ИФА (сочетание электрофореза и ИФА). Методом электрофореза в геле разделяют биополимеры, например, антигены вируса иммунодефицита человека. Затем переносят разделённые молекулы на поверхность нитроцеллюлозы в том же порядке, в каком они находились в геле. Процесс переноса называется блоттинг, а полученный отпечаток - блот (англ. blot - пятно). На этот отпечаток действуют исследуемой сывороткой. Затем добавляют сыворотку против глобулинов человека, меченую пероксидазой, затем субстрат, который под действием фермента приобретает коричневый цвет. Образуются коричневые полосы в тех местах, где антитела соединились с антигенами. Метод позволяет обнаружить антитела к отдельным антигенам вируса.

Радиоиммунный анализ (РИА). Метод позволяет определить количество антигена в исследуемой пробе. Сначала к иммунной сыворотке присоединяют материал, предположительно содержащий антиген, затем - известный антиген, меченный радиоизотопом, например I 125 . В результате происходит связывание определяемого (немеченого) и известного меченого антигена с ограниченным количеством антител. Так как меченый антиген добавляется в определённой дозе, то можно определить, какая его часть связалась с антителами, а какая осталась свободной из-за конкуренции с немеченым антигеном и была удалена. Количество меченого антигена, связавшегося с антителами, определяют с помощью счётчика. Оно обратно пропорционально количеству определяемого антигена.

Иммуноэлектронная микроскопия (ИЭМ). К антигену, например, к вирусу гриппа, присоединяется специфическая антисыворотка, меченая электроноплотным веществом. В качестве метки применяют металлосодержащие белки (ферритин, гемоцианин) или коллоидное золото. При микроскопии в электронном микроскопе делают фотографии, на которых видны вирионы гриппа с присоединившимися к ним тёмными точками - молекулами меченых антител.

Контрольные вопросы

Приобретённый иммунитет, отличие его от наследственного (видового, врождённого). Виды приобретённого иммунитета.

Задача. В семье заболел дифтерией ребенок Валерий, трёх лет. Другие члены семьи не заболели, причём мать переболела дифтерией в детстве, а отец был привит дифтерийным анатоксином. Старшая сестра Наташа, пяти лет, в своё время не была привита дифтерийным анатоксином из-за медицинских противопоказаний, поэтому пришлось провести ей экстренную профилактику с помощью противодифтерийной антитоксической сыворотки. Младший брат, Виталий, трёх месяцев, не заболел, хотя ничем не был привит. В доме есть кошка и собака, они не заболели. Назовите для каждого из членов семьи и для животных вид иммунитета, благодаря которому они не заболели.

Что такое антиген? Какие вещества могут быть антигенами? Полноценные антигены и гаптены, чем они отличаются друг от друга? Структура антигена. Как называется часть молекулы антигена, определяющая его специфичность? Назовите известные Вам антигены. Что такое аутоантигены? Антигенное строение микробной клетки. Жгутиковые и соматические антигены; локализация, буквенное обозначение, химическая природа, отношение к температуре, способ получения, практическое применение. Анатоксин, его свойства, применение, получение. Какая ткань составляет иммунную систему организма? Укажите центральные и периферические органы иммунной системы человека. Опишите процесс формирования гуморального и клеточного иммунного ответа. Укажите клетки, которые осуществляют захват и переваривание антигена; клетки, которые взаимодействуют при формировании гуморального иммунитета, клеточного иммунитета; клетки, которые трансформируются и превращаются в плазмоциты, продуцирующие антитела; клетки, стимулирующие этот процесс; клетки, которые угнетают иммунный ответ; клетки, которые убивают опухолевые клетки, и заражённые вирусом клетки. Что такое антитела? Как получить иммунную сыворотку? Как получить сыворотку, которая бы нейтрализовала столбнячный токсин? Против каких антигенов образуются антитоксины, агглютинины, гемолизины? Какие антитела образуются при введении в организм дифтерийного анатоксина? дифтерийных бактерий? Химическая природа и структура антител. Что такое активный центр иммуноглобулина? Перечислите классы иммуноглобулинов, их свойства. Укажите класс иммуноглобулинов, способных проникать через плаценту. К какому классу относятся секреторные иммуноглобулины? Динамика накопления антител. Чем отличается вторичный иммунный ответ от первичного? Как в практической медицине используются знания о динамике иммунного ответа? Что такое реакции иммунитета, каков их механизм, фазы реакции. В каких 2-х направлениях используют реакции иммунитета? Перечислите реакции иммунитета.

Задача. Поставьте вместо пропущенных слов «анатоксин» или «антитоксин»: _________ является антигеном, _________ является антителом, __________ создаёт при введении в организм активный иммунитет, __________ создаёт при введении в организм пассивный иммунитет, __________ получают путём иммунизации животных, ___________ получают из токсина при воздействии формалином и теплом, ___________ нейтрализует токсины, __________ вызывает в организме образование антител.

Реакция агглютинации: что такое агглютинация, что является антигеном, что - антителом; методы постановки, какие контроли ставятся и для чего; как должны выглядеть контроли. Агглютинирующие сыворотки, что они содержат, как их получают, для чего применяются; что такое титр агглютинирующей сыворотки? Реакция непрямой (пассивной) гемагглютинации: что служит антигеном в этой реакции, как его получают, механизм реакции. Что такое эритроцитарный диагностикум? Что такое антительный эритроцитарный диагностикум? Реакции преципитации: что такое преципитация, что служит антигеном; как получить преципитирующую сыворотку? Что такое титр преципитирующей сыворотки? Методы постановки, практическое применение.

Реакция связывания комплемента (РСК): принцип РСК; что образуется при взаимодействии иммунной сыворотки со специфическим антигеном; что происходит с комплементом, если он присутствует при этом взаимодействии? Какова судьба комплемента в том случае, если между антигеном и антителами нет специфического сродства? Если конечным результатом РСК является гемолиз, что это означает - положительный или отрицательный результат? Методика постановки РСК. Почему исследуемую сыворотку надо инактивировать? Гемолитическая сыворотка: что содержит, как ее получают, что такое титр и как его определяют? Комплемент: химическая природа, отношение к высокой температуре, где содержится? Как можно разрушить комплемент? Что практически применяется в качестве комплемента?

Задача. На одежде человека, обвиняемого в убийстве, обнаружено пятно крови. С помощью какой реакции можно определить, человеческая ли это кровь; что в этой реакции будет антигеном, и что антителами; какой диагностический препарат нужно иметь в лаборатории для этой реакции, как его приготовляют?

Задача. Как при помощи реакции преципитации определить, является ли доставленный для анализа образец мяса крупного рогатого скота или мясом лошади; какие необходимы диагностические препараты?

Реакция преципитации в агаровом геле, способы постановки, практическое применение.

реа́кция свя́зывания комплеме́нта , РСК, реакция Борде—Жангу [по имени бельг. бактериологов Ж. Борде (J. Bordet) и О. Жангу (О. Gengou), 1901], высокоспецифичная и очень чувствительная серологическая реакция, основанная на свойстве комплекса антиген—антитело фиксировать свободный комплемент (), применяемая при диагностике многих бактериальных и вирусных и некоторых протозойных и гельминтозных болезней, а также для изучения процессов, сопровождающихся изменением количества антигена или антител. РСК протекает в 2 фазы: 1) взаимодействие антител, антигена и комплемента, в результате которого свободный комплемент связывается образовавшимся комплексом антиген—антитело (специфическая фаза); 2) индикация реакции сенсибилизированной эритроцитами (неспецифическая фаза). В РСК используют 2 системы: специфическую бактериологическую, состоящую из антитела (испытуемой сыворотки), антигена и комплемента, а также неспецифическую «индикаторную», содержащую гемолизин (гемолитическая сыворотка) и взвесь эритроцитов барана. Антиген соединяется с антителом только в присутствии комплемента. Если испытуемая сыворотка содержит антитела, гомологичные взятому антигену, то присутствующий в реагирующей смеси комплемент адсорбируется образующимся комплексом антиген — антитело и теряет способность лизировать сенсибилизированные эритроциты, то есть без комплемента гемолизин (гемолитическое антитело) не разрушает эритроциты (реакция положительная). В тех случаях, когда между антигеном и антителами испытуемой сыворотки нет специфического родства, комплекс не образуется и комплемент остаётся в свободном состоянии. При добавлении гемолитической системы в этом случае несвязанный комплемент вызывает гемолиз сенсибилизированных эритроцитов (реакция отрицательная). Существуют различные варианты постановки РСК: классический метод постановки в виде макро- и микровариантов, реакция длительного связывания комплемента (РДСК) на холоде, метод количественной РСК по 50%-ному гемолизу сенсибилизированных эритроцитов и др. В ветеринарной диагностической практике чаще применяют классический метод РСК в виде макроварианта, при котором берут каждого компонента по 0,5 или 0,25 мл в определённом рабочем титре. Комплемент титруют в бактериологической системе на сыворотках того же вида животных, кровь которых подлежит исследованию. Испытуемые сыворотки обычно исследуют в разведении 1:5 и 1:10 с антигеном и 1:5 без антигена (контроль). Время связывания комплемента в специфической фазе 20 мин, время реакции гемолиза в неспецифической фазе 20 мин при t 37—38ºC. Для диагностики ряда заболеваний применяют более чувствительный метод — РДСК. При этом первую фазу реакции проводят при t 4—6ºC в течение 16—18 ч, что ведёт к усилению адсорбции комплемента малыми количествами антигена и антител. Затем добавляют гемолитическую систему и реакция протекает при t 37—38ºC в течение 20 мин. Результаты РСК и РДСК учитывают по степени задержки гемолиза, которую обозначают крестами или минусом, соответствующими следующим процентам гемолиза эритроцитов: ++++ от 0 до 10%; +++ от 10 до 40%; ++ от 40 до 70%; + от 70 до 90%; – от 90 до 100%. Ветеринарным законодательством предусмотрены специальные наставления по постановке, учёту и оценке РСК и РДСК для каждой болезни отдельно.

Литература:
Лабораторные исследования в ветеринарии, М., 1971;
Руководство по иммунологии, под ред. О. Е. Вязова и Ш. Х. Ходжаева, М., 1973.

Ветеринарный энциклопедический словарь. - М.: "Советская Энциклопедия" . Главный редактор В.П. Шишков . 1981 .

Смотреть что такое "" в других словарях:

Реакция связывания комплемента - (РСК) серол. реакция, используемая для количественного определения комплементсвязывающих Ат и Аг. Принцип РСК состоит в том, что специфический иммунный комплекс полностью или частично адсорбирует добавленный в систему С. В качестве… … Словарь микробиологии

реакция связывания комплемента - РСК Лабораторный метод. [Англо русский глоссарий основных терминов по вакцинологии и иммунизации. Всемирная организация здравоохранения, 2009 г.] Тематики вакцинология, иммунизация Синонимы РСК EN complement fixation testCFTCF test … Справочник технического переводчика

Реакция связывания комплемента - I Реакция связывания комплемента серологическая реакция, используемая для определения антигена или антитела, основанная на оценке потребления (связывания) комплемента комплексами антиген антитело, см. Иммунологические методы исследования. II… … Медицинская энциклопедия

реакция связывания комплемента - rus реакция (ж) связывания комплемента, реакция (ж) Борде Жангу; реакция (ж) отклонения комплемента; реакция (ж) фиксации алексина eng complement fixation test fra réaction (f) de fixation du complément deu Komplementbindungsreaktion (f) spa… …

реакция связывания комплемента - (РСК), высокочувствительная и специфическая серологическая реакция, применяемая для диагностики многих инфекционных и инвазионных болезней животных. Состоит из двух последовательных фаз. В первой фазе антиген смешивают с испытуемой сывороткой и… … Сельское хозяйство. Большой энциклопедический словарь

реакция связывания комплемента - (РСК; син.: Борде Жангу реакция, реакция отклонения комплемента устар., реакция фиксации алексина устар.) метод серологического исследования, основанный на способности образующегося комплекса антиген антитело связывать комплемент, что выявляется… … Большой медицинский словарь - rus реакция (ж) связывания комплемента, реакция (ж) Борде Жангу; реакция (ж) отклонения комплемента; реакция (ж) фиксации алексина eng complement fixation test fra réaction (f) de fixation du complément deu Komplementbindungsreaktion (f) spa… … Безопасность и гигиена труда. Перевод на английский, французский, немецкий, испанский языки

Комплемента связывания реакция - см. Реакция связывания комплемента. (

Реакция связывания комплемента (РСК) – сложная двухэтапная серологическая реакция. В ней используют пять ингредиентов, составля­ющих две системы: антиген, антитело, комплемент (первая система); эритроциты барана, сенсибилизированные (обработанные) гемолитической сывороткой, содержащей специфические к ним антитела (вторая, или индикаторная, гемсистема). При этом взаимодействие антитела с антигеном на первом этапе реакции приводит к образованию иммунного комплекса, который адсорбирует комплемент, но визуально обнаружить это невозможно. В качестве индикатора связывания комплемента на комплексе антиген–антитело на втором этапе используют гемсистему, кото­рая, являясь иммунным комплексом, тоже способна адсорбировать его. В конечном итоге возможны два вариан­та результата реакции. Если антитело и антиген соответствуют друг другу и комплемент адсорбируется образовав­шимся комплексом, лизиса эритроци­тов гемсистемы не произойдет. При несоответствии антитела антигену, и наоборот, комплемент, оставаясь сво­бодным, присоединится к гемсистеме и вызовет гемолиз.

Как и другие серологические ре­акции, РСК можно использовать для выявления специфических антител по известному антигену или для определе­ния антигена по известным антителам.

Общая характеристика ингредиен­тов РСК.

1. ИССЛЕДУЕМАЯ СЫВОРОТКА перед постановкой реакции прогрева­ется на водяной бане 30 мин для инактивации ее собственного комплемента и разводится начиная с 1:5.

2. АНТИГЕНОМ могут быть культуры бактерий, их лизаты, вирусы и вирус–содержащие материалы, экстракты па­тологически измененных органов и тканевые липиды.

3. КОМПЛЕМЕНТ – сыворотка мор­ских свинок, полученная в день опыта. В настоящее время используется производственный сухой комплемент.

4. ГЕМОЛИТИЧЕСКАЯ СИСТЕМА состоит из смешанных в равных объемах гемолитической сыворотки и 3% взвеси эритроцитов барана по осадку. Для сенсибилизации эритроцитов гемолизинами смесь выдерживают в термостате при температуре 37°С в течение 30 мин.

Постановка основного опыта РСК. В 1 пробирку вносят СЫВОРОТКУ, АНТИГЕН И КОМПЛЕМЕНТ, во вторую – сыворотку, комплемент и вместо антигена изотонический раствор натрия хлорида (КОНТРОЛЬ СЫВОРОТКИ), в третью – антиген, комплемент и тот же раствор натрия хлорида (КОНТРОЛЬ АНТИГЕНА). Пробирки ставят в термостат при температуре 37°С на 1ч. Одновременно готовят гемолитическую систему, которую затем добавляют во все три пробирки после извле­чения штатива из термостата. Смешав гемсистему с ингредиентами трех пробирок, последние вновь ставят в термостат на 1 ч, и спустя это время учитывают результаты РСК.

При учете РСК интенсивность реакции обозначается плюсами: «++++»– резко положительная реакция с полной задержкой гемолиза, жидкость в пробирке бесцветная, все эритроциты осели на дно; «+++», «++» –положительная реакция, отличается нарастанием окраски жид­кости вследствие гемолиза и уменьшения количества эритроцитов в осад­ке; «+» – слабоположительная реакция, жидкость интенсивно окрашена, на дне пробирки незначительное количество эритроцитов. Отрицательная реакция обозначается знаком «–», при этом наблюдается полный гемолиз, жидкость в пробирке имеет интенсивно–розовую окраску («лаковая кровь»).

РСК – весьма сложная, но очень чувствительная специфическая реакция. Широко применяется в диагностике сифилиса, хронической формы гонореи, коклюша, актиномикоза, всех риккетсиозов и вирусных инфекций.

Иммуноферментный анализ.

Метод был разработан в начале 70-х гг независимо друг от друга тремя группами учёных. Метод напоминает РИА, но в его основу положено маркирование Аг или Ат, вступающего в реакцию, ферментом. Взд метки с субстратом обычно сопровождается изменением окраски среды. В настоящее время созданы многочисленные модификации этого метода, но наибольшее распространение получил гетерогенный ИФА на твёрдой фазе (твердофазный). Различают:

1) ПРЯМОЙ ТВЕРДОФАЗНЫЙ ИФА. В этом случае:

1. сыворотку с Ат инкубируют с Аг, фиксированным на твёрдом субстрате (чаще всего это пластиковая микропланшетка).

2. Ат, не связавшие Аг, удаляют многократным промыванием.

3. Вносят меченную ферментом сыворотку к Ат, связавшим Аг.

4. Определяют ко-во фермента–маркёра, связавшегося с Ат.

2) КОНКУРЕНТНЫЙ ТВЕРДОФАЗНЫЙ ИФА.

1. Вносят сыворотку. Если в ней есть специфические Ат, то они связываются с Аг, фиксированном на твёрдом субстрате. Если специфических Ат нет, то Аг оказывается не связанным.

2. При добавлении специфических к фиксированному Аг Антител в первом случае им будет не с чем взаимодействовать (большинство Аг уже связаны) Þ содержание маркёра низкое. Во втором случае специфические Ат будут связываться с Аг и при отмывании они не будут смываться Þ высокое содержание маркёра.

Аналогично м.б. фиксированы АНТИТЕЛА, и различные фирмы выпускают именно планшеты с уже фиксированными Ат.

По сравнению с классическими методами выявления Аг этот метод позволяет непосредственно регистрировать их взаимодействие с Ат, а не вторичные проявления (агглютинацию, преципитацию или гемолиз). Метод очень ЧУВСТВИТЕЛЕН (достаточно концентрации 1нг/мл).

Определяют: Хламидии, клостридии, ВИЧ и др.

8. Реакция фагоцитоза.

Фагоцитоз осущ-ся микрофагами и макрофагами. Стадии фагоцитоза: приближение, прилипание, погружение, переваривание.

Оценка функциональной активности фагоцитирующих клеток.

Колич. оценку фагоцитарной активности гранулоцитов и моноцитов производят в цельной крови, в лейкоцитарной взвеси или в обогащенных фракциях фагоцитирующих клеток. В качестве стандартных объектов фагоцитоза используют монодисперсные частицы латекса диаметром 1,0-2,0 мкм, суспензию убитых нагреванием бактерий или дрожжеподобных грибов.

Фагоциты смешивают с фагоцитируемым материалом в соотношении 1:10 или 1:100 и инкубируют при 37°С в течение 30 мин при постоянном перемешивании. Затем пробирки центрифугируют и осадок ресуспензируют в капле сыворотки крови для приготовления мазка. В мазках, фиксированных краской Май-Чрюнвальда и окрашенных по Романовскому-Гимзе, подсчитывают процент фагоцитирующих клеток (ФП – фагоцитарный показатель) и кол-во поглощенных частиц на 1 клетку (ФЧ – фагоцитарное число).

У здорового человека ФП=40-80%, ФЧ=1-5.

9. Диагностикумы.

Диагностикумы – это взвесь убитых нагреванием или формалином определенных микробных клеток с известным содержанием клеток в единице объема. В качестве антигена могут быть использованы также взвеси живых бактерий. Феномен реакции проявляется предварительно через два часа (при 37 0 С), окончательный результат учитывается при комнатной температуре через 18-20 часов. Для диагностики представляет интерес положительная реакция только в опре-деленном титре сыворотки, который служит диагностическим. Так, при бруцеллезе диагностический титр 1:200, а при туля-ремии -1:100. Для выявления антител можно ставить экспрессные реак-ции агглютинации (время учета несколько минут). Например: 1. Кровяно-капельная реакция при туляремии. В каплю цельной крови больного на специальном стекле наносят кап-лю дистиллированной воды (для гемолиза) и каплю туляре-мийного диагностикума. Реакция происходит в течение 1-2 минут, хорошо видны агглютинаты в виде белесых комочков. 2. На стекле проводится экспрессная реакция агглютина-ции по Хеддельсону при бруцеллезе.

Данные реакции не позволяют определить количество ан-тител в сыворотке.б) для идентификации чистой культуры возбудителей ин-фекционных болезней. С этой целью используются иммунные диагностические

агглютинирующие сыворотки, выпускаемые институтамивакцин и сывороток, путем иммунизации животных целымимикробными клетками. Для достоверности сыворотки лучше использовать адсор-бированные, чтобы в них содержались только антитела, соот-ветствующие определенному виду или типу микроорганизма.

Принципы получения иммунных сывороток.

Иммунная сыворотка (антисыворотка) представляет собой сыворотку крови, содержащую антитела к данному антигену. В большинстве случаев иммунные (диагностические) сыворотки к микробным, тканевым и другим антигенам получают экспериментальным путем, иммунизируя животных соответствующими антигенами.

В числе основных требований, предъявляемых к антисывороткам, - их высокая специфичность и достаточное содержание антител. По специфичности различают поливалентные (полиспецифические) и моновалентные (моноспецифические) антисыворотки. Поливалентные сыворотки содержат антитела ко многим антигенам, моноспецифические - к одному конкретному антигену. Получить моноспецифические сыворотки можно:

1) используя для иммунизации животных высокоочищенные антигены,

2) очищая нативные сыворотки от антител нежелательной специфичности.

Для этого используют:

1) иммуноаффинный метод, в основе которого лежит связывание антител определенной специфичности соответствующими антигенами, иммобилизованными на твердофазном носителе, с последующим разделением образовавшихся комплексов АГ -АТ и выделением антител;

2) метод адсорбции по Кастеллани. Для этой цели к нативной иммунной сыворотке, содержащей группоспецифические перекрестно реагирующие антитела, последовательно добавляют микроорганизмы, в состав которых входят все групповые антигены, адсорбируя таким образом гомологичные анти-

тела. Такие адсорбированные моноспецифические антисыворотки содержат антитела к различным детерминантам молекулы антигена, которые гетерогенны по классовой (подклассовой)